Share | Quantitation for siRNA Therapeutics: A Comparison of Methods from Multiple Bioanalytical Platforms

导语

近十年来，寡核苷酸药物的研究热度持续攀升，期间全球共有9种反义寡核苷酸（ASO）药物和5种小干扰RNA（siRNA）药物相继通过监管审批上市。这类治疗药物通过与内源性RNA序列互补配对发挥作用，其作用模式主要分为两类：一是通过多种机制调控目标基因的表达，二是借助内切酶切割触发RNA降解。为了评估其有效性与安全性，在非临床及临床研究阶段均需建立精准可靠的生物分析方法以实现定量检测。

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）目前是siRNA药物定量分析的首选技术方案，在已获批的5款siRNA治疗药物中，有4款采用该技术。在2019年进行的行业调研中，75%受访者倾向于选择LC-MS平台作为寡核苷酸药物的分析平台，搭配使用固相萃取（SPE）或液液萃取（LLE）技术作为样本前处理方案。

除LC-MS外，杂交酶联免疫吸附测定（HELISA）、茎-环反转录定量PCR（SL-RT-qPCR）及液相色谱-荧光检测法（LC-FL）也是寡核苷酸分析的常用技术。这些方法均通过特异性探针或引物实现目标链的分离富集，其中HELISA和LC-FL已成功支持寡核苷酸药物的规范性申报。最近，基于杂交捕获的样品制备新技术已与LC-MS联用，但该方法尚未被纳入药物研发规范性申报体系。

综合来看，基于固相萃取（SPE）或液液萃取（LLE）的LC-MS具有三大优势：采用通用型试剂耗材、方法开发周期相对较短、具备代谢产物鉴定潜力，同时保持了良好的分析特异性。相较而言，HELISA及qPCR技术体系在灵敏度和检测通量方面表现突出，但存在两大局限：（1）需要针对特定分析物开发专用试剂，开发周期显著延长。（2）难以区分寡核苷酸母药与其代谢产物。基于杂交的LC-MS定量下限（LLOQ）通常≤1 ng/mL，接近HELISA或qPCR检测法的水平。这些检测仍保留了LC-MS/MS检测的通量、特异性和代谢物鉴定潜力。然而，目前多数对比研究往往未对同一待测物在不同检测平台上的表现进行系统评估，难以明确区分检测差异源于平台自身特性还是化合物固有属性。

本研究首次系统比较了四种主流检测技术（Hybrid LC-MS、SL-RT-qPCR、HELISA和SPE-LC-MS）在定量分析21-mer脂质偶联siRNA药物SIR-2时的性能差异。

方法与结果

研究发现，尽管所有方法均可用于SIR-2的定量分析，但它们在灵敏度、特异性和分析速度方面存在显著差异。

在灵敏度方面，Hybrid LC-MS和SL-RT-qPCR表现最佳，最低定量限分别为0.200 ng/mL和0.128 ng/mL。HELISA的灵敏度为1.00 ng/mL，而SPE-LC-MS的灵敏度最低，为5.00 ng/mL。

在特异性方面，只有LC-MS方法（Hybrid LC-MS和SPE-LC-MS）能够区分SIR-2及其代谢产物。HELISA和SL-RT-qPCR无法区分母体药物和代谢产物，可能导致总浓度的高估。药代动力学研究中，SL-RT-qPCR和HELISA测得的浓度通常高于LC-MS方法。

在分析速度方面，SL-RT-qPCR和HELISA速度最快，可在8 ~ 12小时内完成样本分析。而Hybrid LC-MS和SPE-LC-MS分别需要约20小时和24小时。

在方法开发方面，SPE-LC-MS由于通用性强，无需定制试剂，开发时间最短。其他方法需要定制探针或引物，开发时间较长。SL-RT-qPCR在分析具有相同原始序列但不同化学修饰的分子时具有一定通用性。

综上所述，每种方法都有其优势和局限性。选择最合适的方法取决于具体研究需求，如灵敏度、特异性或分析速度。对于SIR-2的样本分析，SL-RT-qPCR因其高灵敏度、快速分析和可接受的特异性而被认为是最合适的选择，尤其是对于需要快速处理大量样本的临床前和临床研究。Hybrid LC-MS可作为补充方法，用于分析选定样本中的代谢产物，提供高灵敏度和特异性的定量结果。

结语

本研究结果为寡核苷酸药物的生物分析提供了有价值的参考，强调了在药物研发过程中选择合适分析方法的重要性。未来的研究应进一步探索不同分析平台在定量分析相同分析物时的差异，以更好地理解寡核苷酸药物的修饰、偶联或核苷酸长度对方法间可比性的影响，从而为药物开发的各个阶段选择最合适的分析方法提供指导。

*注：本文由 康维讯生物 科学家翻译整理，参考文献见附录。

参考文献：

[1]. Karan Agrawal, Laurelle K Calliste, Shaofei Ji, et al. Comparison of multiple bioanalytical assay platforms for the quantitation of siRNA therapeutics[J]. Bioanalysis. 2024;16(13):651-667.

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