Case Sharing | Customization Service of a NGS-Based Method for Gene Editing Analysis

分析实例分享

基因编辑技术中分析方法的定制服务

在基因编辑技术中涉及各类分析方法的检测与应用，医药企业在相关产品的研发过程中，可能因为方法的标准化不足或者缺乏相关试剂使得研发进程受阻或者效率不理想。康维讯生物助力基因编辑技术所涉及的检测方法开发和相关平台的实践应用，为细胞基因治疗（CGT）产品的药物研发提供有力的支持。康维讯生物本推文介绍1款基因编辑技术所涉及的技术服务。

高效、灵敏、精准的基因编辑产品NGS检测方案定制服务

基于扩增子或靶向捕获深度测序全面评估基因编辑技术的有效性和安全性

基因编辑产品

基因编辑产品的有效性和安全性问题

以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑工具使用方便，编辑效率很高，但编辑模式（即编辑后修复形成的变异类型和丰度）存在多样性，进而影响基因编辑的有效性。准确地检测编辑模式是准确评估基因编辑有效性的基础，但目前基因编辑领域常用的Sanger测序法既无法准确评估编辑效率，又无法获得编辑模式信息。另一方面，基因编辑也存在脱靶编辑的可能性。最常见发生脱靶的是基因组中和sgRNA具有高度相似性的位点，其次是非预期修复的在靶位点，以及因生长优势选择出的间接性突变位点，比如DNA修复基因P53突变等（图1）。这些情况可能导致癌基因激活或抑癌基因失活，给基因编辑产品带来安全性风险。因为DNA基因编辑的不可逆性，在临床使用中对脱靶风险进行评估是非常有必要的[1]。利用NGS方法，可以同时对在靶位点和脱靶位点进行检测，实现对基因编辑产品有效性和安全性的系统评估。

图1 基因编辑引起的预期外突变

产品设计理念

我们通过合作方提供基于扩增子或靶向捕获深度测序检测基因编辑产品在靶和脱靶编辑效率的定制化服务

可定制检测灵敏度。使用定制化的唯一分子标签（UMI）技术追踪原始输入分子，有效降低假阳性变异的检出概率，同时提高变异检测的灵敏度， 检测限可达0.1%以下，尤其适用于低频脱靶的检出。

可定制检测位点数量和类型。目标区域可覆盖Kb ~ Mb区域，突变类型涵盖单核苷酸变异、片段插入和缺失、拷贝数、结构变异和基因融合等。

全流程一站式解决方案。目前平台可提供2种定制化试剂盒和软件套装：  -扩增子测序：UMI-Amplicon-Seq^TM  -靶向捕获测序：UMI-Capture-Seq^TM

可定制报告格式，包括交互式HTML，Word和PDF。

扩增子测序UMI-Amplicon-Seq^TM技术检测流程

基于分子标签技术的扩增子测序（UMI-Amplicon-Seq^TM）通过对靶基因区域附近设计引物（自主知识产权），对目标区域进行富集。在PCR的前两个循环加上UMI，再进行常规PCR扩增，然后对PCR产物进行高通量测序，可快速高效获得目标区域的突变信息，性价比较较高。

图2 扩增子测序检测流程

靶向捕获测序UMI-Capture-Seq^TM技术检测流程

基于分子标签技术的靶向捕获测序（UMI-Capture-Seq^TM）对打断后的基因组DNA连接带有UMI的接头，通过捕获探针对感兴趣的区域进行分离和富集。相比于扩增子测序可扩展性强，可随时添加新的靶位点，并可检测拷贝数变异、结构变异、基因融合等多种变异类型。

图3 靶向捕获测序检测流程

eFalconGET^TM基因编辑分析软件简介

eFalconGET^TM分析软件针对上述扩增子测序（UMI-Amplicon-Seq^TM）和靶向捕获测序（UMI-Capture-Seq^TM）伴随开发分析模块。分析软件经严格的计算机系统验证，保证生信分析的准确性。软件特点：

支持多种比对算法（Needleman-Wunsch、Smith-Waterman、Minimap)，根据需求自由选择和定制参数。

支持Cas9和Cas12等多种编辑模式。

支持单样本和配对样本分析两种模式。

参考文献

[1] Uchida E. Regulations and safety assessment of genome editing technologies for human gene therapy[J]. Translat Regulat Sci. 2020; 2(3):107-114.