Case Sharing --- Method for Assessing Stem Cell Proliferation and Differentiation Capabilities and Chemotaxis Determination Kit for Gene Editing Products

分析实例分享

基因编辑技术中分析方法的定制服务

在基因编辑技术中涉及各类分析方法的检测与应用，医药企业在相关产品的研发过程中，可能因为方法的标准化不足或者缺乏相关试剂使得研发进程受阻或者效率不理想。康维讯生物助力基因编辑技术所涉及的检测方法开发和相关平台的实践应用，为细胞基因治疗（CGT）产品的药物研发提供有力的支持。康维讯生物本推文介绍2款基因编辑技术所涉及的检测服务方法，可提供相关的检测试剂盒或者检测服务。

造血干细胞增殖/分化效能检测试剂盒

火石检测计划

通过检测细胞内能量变化，评估造血干细胞增殖/分化能力

人造血干细胞（Hematopoietic stem cell, HSC）在不同的促增殖和分化的胞外信号刺激下，可增殖并分化成红、髓和淋系血细胞。细胞增殖和分化需要化学能量的支持。细胞内三磷酸腺苷（Intra-cellular adenosine 5'-triphosphate，iATP）是细胞内最丰富的化学能量载体，由细胞内线粒体产生。若不能产生ATP，则表示细胞已进入代谢性死亡[1]。

本产品可用于：

评估HSC活率和增殖/分化效能，可用于干细胞移植平台监控HSC质量[2]；

优化HSC体外培养条件（如生长因子、培养基等，见图1）；

筛选靶向调控HSC或者肿瘤干细胞增殖/分化药物。

图1 不同促增殖信号对人HSC增殖、分化效能和iATP含量的影响

试剂盒操作及流程

本试剂盒操作便利，对检测人和实验仪器的要求低，可及性高

实验操作流程（图2）：

配制特殊培养基，GEM培养基（促进髓、红系分化）和LGEM培养基（促进髓、红和淋系分化）；

按一定浓度梯度稀释待测样品和标准品细胞，加入96孔板；

按实验需求在适宜条件下培养5天或7天；

培养结束后，加入ATP检测试剂，促使发光反应；

利用酶标仪器，检测待测液的信号值，计算相对光单位（Relative light unit，RLU）；

利用标准品RLU数据，对样品检测结果进行标准化处理。

图2 造血干细胞增殖/分化效能检测的操作流程图

检测结果与数据分析

利用细胞标准品进行标准化分析，使结果更具可信度和科学性

数据标准化统计策略为：

以细胞接种密度（cells/well）为x轴，ATP浓度（µM）为y轴，通过四参数线性拟合分别获得待测样品和标准品细胞的特征性ATP直线方程（图3A）；

计算待测样品与标准品细胞的直线方程斜率比（SR），评估样品的增殖/分化效能。

SR越高，代表增殖/分化效能越好（图3B）。

通过多次检测实验发现，本产品具有高灵敏度，以及良好的稳定性和重复性

ATP检测范围可覆盖0 ~ 10 µM；

几何变异系数 < 15%；

线性拟合系数R2 > 0.94。

图3不同造血干细胞样品的iATP结果统计和比较

试剂盒优势

与传统CFU检测法相比，具备实验耗时短、费用低、检测过程自动化的优点

细胞克隆形成单位（CFU）检测法是目前较常用的评估人造血干细胞分化/增殖效能方法。我们发现，ATP法与CFU法检测结果呈现密切相关性，提示ATP法具备对HSC的分化/增殖效能评估的特异性（图4）。然而，相较CFU法，本产品检具备耗时短、费用低、检测过程自动化程度高等优点（表1）。

图4 iATP法与CFU法相关性分析

表1 iATP法与CFU法各参数的比较

参考文献

[1] Rich IN. Measurement of hematopoietic stem cell proliferation, self-renewal, and expansion potential[J].Methods Mol Biol, 2015;1235:7-17.

[2] John Patterson, Cally H Moore, Emily Palser, et al. Detecting primitive hematopoietic stem cells in total nucleated and mononuclear cell fractions from umbilical cord blood segments and units[J].J Transl Med. 2015;13:94.

HS-Transwell^TM趋化性检测试剂盒

“流浪细胞”检测计划

通过细胞流体力学，评估细胞趋化效能

趋化性（Chemotaxis）是指细胞被特定信号因子招募，发生主动迁移现象[3]。

本产品可用于评估（图5）：

造血干细胞植入和归巢能力

免疫细胞抗炎和靶向肿瘤效能

组织再生

肿瘤细胞转移和浸润能力

图5 细胞趋化性

试剂盒操作及流程

体外创造差异化趋向环境，评估细胞主动迁移能力

利用3D打印技术，设计水平串联可穿透性培养小室（Horizontal Series-Transwell^TM, HS-Transwell^TM）。同时，结合聚酯膜模拟血管内皮情况下，利用不同浓度的趋化因子组合，体外创造差异趋化环境。通过化学发光法，检测细胞主动迁移情况。

HS-Transwell^TM实验操作过程（图6）

分别配制低和高浓度的趋化因子培养基；

将待测细胞样品利用不含趋化因子培养基配置成1 ~ 2 × 106/mL细胞悬液，并加入150 µL至第1、4号HS-Transwell^TM；

将150 µL低浓度趋化因子培养基加入第2、5号HS-Transwell^TM；

将150 µL高浓度趋化因子培养基加入第3、6号HS-Transwell^TM。当然，趋化因子培养基和细胞悬液的加样次序也可根据实验需要进行调整；

将150 µL待测细胞样品悬液加入7号HS-Transwell^TM，作为阳性对照孔，以及在8号HS-Transwell加入150 µL无细胞不含趋化因子培养基，作为阴性对照孔；

将每排HS-Transwell^TM组装入方形96孔板管架，静置于37℃，2 ~ 4小时；

加入15 µL活细胞显色试剂（如CCK-8，ATP指示试剂等）至每个HS-Transwell^TM，孵育后10 ~ 30分钟后，用酶标仪进行读取孔内化学信号值（OD值）。

图6 HS-Transwell^TM实验操作路程图

“流浪细胞”Wonderingcell^TM微流控芯片

利用了3D打印技术，我们自主开发并制作了微流控芯片，以满足在微尺度下精确控制细胞微环境和实时观测细胞迁移的动态过程。同时，也可根据客户需求对微流控系统进行定制化服务。

HS-Transwell^TM 优势

HS-Transwell^TM具备检测过程自动化程度高、实验价格便宜和耗时短等优点

目前，广泛用于检测细胞趋化性的技术均通过利用Transwell装置实现的。但在监控和评估细胞趋化性时，只能通过人工或利用高通量图像细胞计数仪、流式细胞仪技术和显微镜下图像呈现的方法来实现半定量或定量统计。虽然这些方法可生成一些高通量的数据，但实验操作过程容易引入较多的人为误差。且检定用仪器价格较昂贵，阻碍了实验方法的推广（表2）。

表2 HS-Transwell^TM与传统Transwell检测比较

参考文献

[3] Sai J, Rogers M, Hockemeyer K, et al. Study of chemotaxis and cell-cell interactions in cancer with microfluidic devices[J].Methods Enzymol. 2016;570:19-45.