Overview of Bioanalysis of Gene Therapy Products

基因治疗

基因治疗（Gene therapy）是指将外源遗传物质通过基因转移技术引入患者适当的靶细胞内，使外源基因直接作用或表达目标产物从而达到治疗疾病的生物医学技术。随着基因编辑技术、载体改造技术的逐步成熟和基因治疗产品的上市，全球的基因治疗领域快速升温，各大药企的在研新药大量涌入临床，截至2022年末，全球共计45款基因治疗产品获批上市，其中2022年美国FDA和欧盟EMA共批准9款基因治疗产品上市。广义的基因治疗药物包括DNA类药物（包括基于载体介导的体内基因治疗药物（如图1）、体外基因修饰的细胞治疗产品（如图2）、裸质粒药物等）和RNA类药物（包括反义寡核苷酸药物、siRNA药物、mRNA药物等），或称为细胞与基因疗法（Cell and Gene Therapy, CGT）。基因治疗能够克服传统小分子药物和抗体生物药仅在蛋白调控水平进行干预的局限性，可在基因调控水平上直接干预基因表达、沉默、修正的手段来实现疗法升级、肿瘤或遗传性疾病的治疗，做到真正的“治标治本”。狭义的基因治疗主要指将含有外源遗传物质的治疗产品直接注射至人体内，而不是经过体外基因转导至靶细胞并回输人体的方式（或称为细胞疗法），因此基因治疗与细胞治疗具有一定的差异性，推文主要探讨狭义的基因治疗生物分析。

图1 In Vivo 基因治疗

图2 Ex Vivo 基因治疗

基因治疗生物分析

由于基因治疗复杂的药物机制、高门槛的生物分析开发、法规监管要求仍处于待完善阶段、有限的同类产品经验和生物分析共识的欠缺，使得基因治疗产品相比传统药物的生物分析更具挑战性，分析的策略更为复杂、方法学开发和验证的难度也更高。在临床前/临床研究阶段提供的生物分析涉及药理药效学研究、药代动力学研究、毒理学研究、免疫原性研究、安全性研究、生物标志物研究等方面。基因治疗产品采用独特的递送和治疗机制，必须设计并开发非传统和全面的生物分析测试方法来检测基因治疗的安全性和有效性。基因治疗通常是通过载体递送，因此需要监测针对载体的抗体产生，还需注意病毒类载体在患者机体中有预存抗体的情况。还应特别考虑的是，宿主免疫系统可能将表达的治疗性产物蛋白识别为外源物质而产生免疫反应。生物分析还需要确定目的基因表达产物蛋白的存在，作用部位和生物分布。基因治疗需要面临毒性或诱导免疫反应的挑战，临床上最常观察到的基因治疗毒性是肝毒性和细胞因子释放综合征（Cytokine release syndrome，CRS）。

药代动力学评估

基因治疗的PK/PD生物分析研究是药物研发的一个关注重点，当递送系统采用病毒为载体时，从载体给药到基因转导，以及基因产物的生物合成、释放、分布、代谢和消除都会经历极为复杂的过程。

生物分布

基因治疗产品的生物分布反映为药品在体内靶组织和其它各类组织器官的分布、蓄积和代谢清除情况。在设计临床组织样品的采集时，取样时间节点应至少涵盖峰值和稳态阶段的时间点；如果有可能的话，采集的样品应包括靶组织和非靶组织。在提取样品基因组DNA或RNA后，测定其基因治疗产品的目的基因或拷贝数，以进行效价分析。常用于生物分布研究的组织样品有外周血（血清、血浆）、给药靶组织、肝脏、肾脏、肺部、皮肤、胃部等。用于检测基因治疗产品的生物分布和病毒脱落最常用、最重要的技术平台是实时荧光定量PCR（qPCR）和数字PCR技术，它可以检出并定量DNA在目标生物组织内的情况，通过数据计算和分析，获得每个细胞内目的基因拷贝的平均数，即基因治疗产品的目的基因拷贝数（Copy number variation，CNV）。该方法具有高特异性、高灵敏度、可重复性、高通量和标准化分析的特点。不过，组织样品在DNA或RNA提取过程中可能受到PCR抑制剂的污染，影响PCR扩增效率，导致不同类型的组织可能产生一定差异，因此，清洁的实验室环境（一般要求特别设计的实验室）和良好的操作习惯对于基因治疗产品的生物分析非常重要。而且，PCR法有时难以区分完整病毒和非感染性、已降解病毒目标扩增位点的差异，在使用PCR法检测时应留意其局限性。

在利用某些病毒载体（如慢病毒、逆转录病毒等）转导目的基因序列插入基因组时是具有随机性的，因此基因治疗产品整合到体细胞基因组中可能发生基因异常失活，如果整合到某些细胞分裂相关的控制元件或基因时可能会致癌，产生非预期的基因表达风险。根据《人用基因治疗制品总论》中3.1节描述：“应检测重组载体基因组或质粒的完整性和均一性，进行载体递送的治疗序列和选择/调节元件的表型鉴别和分析。对于病毒载体，适当情况下应测定插入位点，并充分评估插入突变的可能性和相关风险；对于质粒，应确认复制起点的位置以及是否存在CpG序列（如果与制品的设计相关）；对于细菌载体，应确认是否存在涉及制品安全性的插入/删除序列；对于转导的细菌载体，应检测质粒和相关调控/控制元件的存在及序列”。检测重组细胞的整合位点来评价基因治疗产品的安全性显得尤为重要，常规PCR技术对这类考察目的的检测具有一定的局限性的，为了全面地检测临床研究中基因治疗产品的基因组整合状况，整合位点分析（Integration site analysis, ISA）常会使用二代测序方法（Next-generation sequencing, NGS）进行安全性评估。ISA可以确认目标细胞/组织中所整合基因的定性与定量情况，也可以识别目的基因的整合位置。对于无整合风险的病毒，则不用考虑此分析。

载体脱落

基因治疗的载体脱落反映为治疗产品通过分泌物和/或排泄物排出体外，应根据基因治疗产品的特点（如基因治疗产品具有一定的复制性）来评估载体脱落分析的必要性。载体脱落的生物分析应进行核酸检测目的基因的脱落动力学以及需要考虑脱落成分的感染能力，根据产品的载体脱落特点和感染风险，在临床试验中采取相应的风险控制措施。载体脱落的检测方法同样可以采用qPCR或数字PCR来测定目的基因的拷贝数，而感染性分析一般采用基于细胞的体外检测进行分析完整的且具有潜在传播能力的病毒或载体。在临床阶段，基因治疗产品的目的基因检出呈阳性时，可进行TCID50细胞体外感染法测定病毒感染滴度，以评估脱落病毒的感染性。由于检测依赖细胞感染，采用TCID50方法面临的挑战主要有精密度较低、变异系数较大、方法开发和验证周期长、通量低。

药效学评估

基因治疗产物蛋白的药代动力学或暴露一般不遵循传统大分子生物制剂的药代动力学模型，因为一般所设计的产物蛋白是组成型表达，缺乏一定的时空特异性，产物蛋白的暴露不会严格遵循典型的代谢阶段（或ADME）。这些产物蛋白有可能仅集中在作用位点表达，或者随循环系统分布全身，这依赖于产物蛋白本身以及特殊的给药方式。产品有效性评估的生物分析策略需要能够在各作用位点准确检出产物蛋白，并监测产物蛋白的持续表达，能够为临床剂量选择、临床有效性、安全性提供证据支持。产物蛋白表达水平过低可能无法达到药效剂量水平，而过高则可能带来额外的安全风险，监管机构对基因治疗的长期安全性也具有明确的要求，详见《基因治疗产品长期随访临床研究技术指导原则（试行）》。

产物蛋白表达水平

检测产物蛋白变化水平的生物基质是设计生物分析方案时必须要考虑的，可能需要对多种生物基质进行产物蛋白的监测，例如最常见的给药部位的靶组织、血液（血清或血浆）、脑脊液（对于神经系统给药）、玻璃体液（对于眼球给药），甚至某些特殊基因治疗产品需要对皮肤或肌肉等可及的活检部位中监测患者机体的产物蛋白表达水平（图3）。另一方面是稳定性的考察，尤其对于产物蛋白为酶类的基因治疗产品，在临床治疗收集受试者的生物样品时需要考虑样品处理对生物基质中产物蛋白的稳定性影响。与传统大分子生物制剂在血清样品中进行标准化的药代动力学测试相比，基因治疗产品的生物基质可能来自多种组织或体液，在到达生物分析实验室之前需要更为规范的生物基质处理，以确保产物蛋白的稳定性。这可能包括临床样品的快速采集和运输、恒定低温储存减少反复冻融、控制样品的总储存时间（至少在已经过验证的时间节点之内）、添加基于不同生物基质的稳定剂（例如降解抑制剂）。

图3 产物蛋白检测结果

在AAV5-hFVIII-SQ给药后分别使用显色法（绿色）和一步法（橙色）测定循环FVIII活性水平，结果表明产物蛋白在前20 - 28周缓慢增加，达到峰值后缓慢减少。与此前报道一致的是，一步法检测值比显色法检测值高1.65倍。菱形表示平均值，水平线表示中位值，方框上下边界表示第25和75分位，竖线上下表示最大值和最小值。低于定量限时显色法估算为1.5 IU/dL，一步法为0.5 IU/dL。注：显色法（Chromogenic assay），一步法（One-stage assay）

对于不存在内源蛋白的情况，患者可能几乎不表达（基因治疗产品）产物蛋白同源的内源蛋白，在基因治疗后目的产物蛋白的浓度可能出现极高的数量级跃迁。设计和应用生物分析方法具备超高灵敏度（ng/mL，甚至pg/mL的级别）的同时，也需要兼具较宽的动态范围，以进行充分的产物蛋白药代动力学/药效学表征。首选的生物分析方法是免疫分析测定法，其方案设计原理相对简单且直接、可快速制备关键试剂或直接使用商业化试剂、较为成熟的标准化和自动化流程以满足高动态范围、高灵敏度的生物分析要求。免疫分析测定法的设计需要考虑所选抗体对能否正确区分可能存在的截短蛋白或其它无功能蛋白，以避免潜在的干扰。常用于产物蛋白的免疫分析测定法有：酶联免疫吸附测定法（ELISA）、MSD、Luminex等。

对于存在内源蛋白的情况，可能会预先存在一定表达水平的与基因治疗产品相似的内源蛋白，在基因治疗后产物蛋白（外源蛋白）的浓度具有一定程度的变化。由于基因治疗产物蛋白与内源蛋白的生物学结构功能相似度较高，内源性干扰大幅增加了设计仅针对产物蛋白药代动力学/药效学生物分析的复杂性。最理想的情况是，生物分析方法所选用的捕获抗体和侦测抗体对能够准确地检测并区分（外源）产物蛋白和内源蛋白（如果二者存在区别的情况下），以最大程度减少内源性干扰，如果该生物分析方法足以达到分析灵敏度、特异性、精密度等验证项的可接受标准，则生物分析的适用环境与第一种情况是类似的。一般情况下，内外源蛋白所存在差异的表位是有限的（有时甚至可能仅是单个氨基酸的差别），且因患者个体差异还会导致多种不同的血清学表位差，则分析方法难以区分，因此，内源性干扰是产物蛋白分析的一大挑战。

另一挑战则是标准品的制备，标准品需要在除去内源蛋白的生物基质中制备，而可控且标准的制备方法需要大量精力进行开发，或者考虑使用分析缓冲液/分析稀释剂进行制备，但这类制剂与实际样品的生物基质有一定程度的差异，能否直接作为产物蛋白生物分析的标准品制剂需要谨慎的考量，这可能需要经过严格的验证来确定其适用性。不过，与生物标志物的生物分析相似，常用策略依然是直接使用商业化（或由实验室自备并出具COA文件）的分析缓冲液/分析稀释剂与相应的重组产物蛋白一同制备成标准品，对这类参考生物基质的适用性建议进行验证实验。

产物蛋白活性

除了对产物蛋白的定性和定量外，部分基因治疗产品的临床应用还需要对产物蛋白的活性进行评估。确定基因治疗产品疗效的金标准是临床响应的最终结果，但全面、系统的生物分析应当包含基因治疗产品的作用机制和MOA。通过使用替代药代动力学/药效学的功能分析来实现产物蛋白的生物分析，如酶活性分析。当产物蛋白的定量分析结果结合活性分析时，由于活性分析有时能够耐受更大的分析变异性和较小的动态范围，活性分析可能提供额外的信息，能够更为全面的了解目的基因表达产物活性随时间变化的规律。基于两者（药代动力学/药效学与功能分析）不同的生物分析维度，有助于提高产生分析数据的生物学意义，同时增强了检测各治疗组间细微差异的分辨能力。不过，与蛋白质水平的分析相比，酶活性分析通常对患者样品中的稳定性要求更为苛刻。酶促检测可使用与前述QC质控品类似的策略进行验证，并且建议使用重组酶或内源性质控品混合物来监测由环境条件导致潜在的检测性能变化。

免疫原性/安全性评估

检测基因治疗产品的目的基因和表达的产物蛋白只是整个基因治疗生物分析的一个组成部分。根据具体产品特性以及法规的要求，安全性和免疫原性分析也是临床前/临床生物分析的一个极为重要的组成部分。尽管目前基因治疗所应用的病毒载体本身大多具有良好的安全性，但非预期的免疫原性反应是需要重点考虑的。针对基因治疗产品的免疫原性可能涉及：1）病毒载体直接激活的固有免疫反应，并产生急性毒性；2）预先存在的抗病毒载体或产物蛋白的中和性抗体；3）针对病毒载体和产物蛋白引起的适应性体液免疫和适应性细胞免疫反应。

固有免疫反应

固有免疫系统的细胞可识别并吞噬病毒载体的衣壳，在核内体降解后导致治疗产品的目的基因与衣壳蛋白暴露于Toll样受体上（如TLR2和TLR9），从而激活固有免疫反应。固有免疫反应诱导产生的促炎因子、生长因子、趋化因子能够干扰目的基因的转导、表达，对基因治疗产品的疗效产生负面影响。

病毒载体的预存抗体和体液免疫原性

在开展免疫原性评估计划时，需要考虑标准的抗药抗体（Anti-drug antibody，ADA）和中和抗体（Neutralizing Antibody, NAb）免疫原性分析，也需要考虑产品在治疗开始之前以及整个临床试验研究进程中对病毒载体和（外源）产物蛋白预存的抗体进行检测。常用于基因治疗产品的病毒载体通常是自然界广泛存在的，例如腺相关病毒（Adeno-associated viruses， AAV）、腺病毒（Adenovirus, Ad）和单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）。在临床试验中，受试者可能在入组前已经接触并感染过这些病毒，并产生针对性的抗病毒抗体，因此在基因治疗产品用药前必须评估受试者预存抗体的免疫原性，以确保治疗产品可以安全地运输至目标组织部位并发挥治疗效果。事实上，许多基因治疗产品的临床研究方案已将病毒载体的预存抗体筛选作为入组标准的一部分，对于高水平预存抗体的受试者可能会排除在临床试验之外，亦或是对此类受试者进行给药剂量调整、补充空病毒载体衣壳等方式将其纳入临床试验。

载体病毒的体液免疫反应的分析采用类似于传统大分子生物制剂的ADA/NAb免疫原性测定方法，可用桥接法或免疫夹心法的ELISA测定抗病毒衣壳的总ADA，也可以采用基于细胞的体外转导抑制试验检测抗病毒衣壳的中和抗体。如果预存抗体太多导致定性分析难以进行，也可以使用滴度分析的方式，通过比较基因治疗产品给药前后抗体滴度水平的变化评价ADA产生的情况和相对浓度水平（例如Roctavian®对总ADA体液免疫原性的检测，图4）。设计病毒免疫原性测定的挑战包括关键试剂和病毒株间的交叉反应（非特异性）。关键试剂首选从商业化产品的途径获得，例如AAV2、AAV5的病毒衣壳。不过，基于不同设计原理的基因治疗产品可能不能使用通用型的试剂，这时需要考虑定制的关键试剂，如非标准毒株的衣壳、阳性对照抗体等。

中和抗体NAb的检测设计是将报告基因（常用的有：荧光素酶报告基因、GFP、LacZ等）额外转入病毒载体，以获得评估NAb免疫原性的关键试剂。与血清样品预先孵育后进行细胞感染评估，测定病毒载体的转导效率。NAb能够抑制病毒载体转染至靶细胞，因此，若血清样品存在NAb的情况下，会导致检测信号降低。通常用50%的抑制阈值定义血清样品中的NAb检测阴阳性结果和效价的报告，不过，阈值是依赖经验确定的，不同基因治疗产品、检测试剂、试验方案都有可能影响阈值的设定。在制备关键试剂时转染效率尤为重要，更低的空衣壳率会提高报告基因的表达和检测，进一步影响病毒载体NAb检测的精密度和灵敏度。在方法开发时应尽早确认关键试剂的适用性，并对其进行验证，来保障关键试剂的质量以及后续的生物分析方法开发。需要关注的参数可能包括：细胞系（HEK 293、HeLa、CHO等）、个体血清样品（尤其是阴性个体血清样品的筛选）、报告基因（荧光素酶报告基因、GFP、LacZ等）。预存抗体的存在会干扰并使得检测方法的开发复杂化，这需要对个体血清样本进行广泛的预筛选获得阴性对照样品池，以确定Cut Point值。

图4 总ADA体液免疫原性检测结果

受试者分别在入组筛选和Roctavian®给药前1天进行的AAV5中和能力检测结果显示均为阴性，总ADA检测结果（范围：0.65 – 1.05）均低于cut-point 1.15。受试者在第一个给药时间点8周总ADA滴度显示为阳性，在第40周滴度达到峰值并长期保持高水平滴度。注：中和能力检测方法为Cell-based AAV5 transduction inhibition assay，总ADA检测方法为Bridging electrochemiluminescence assay。

产物蛋白的预存抗体和免疫原性

受试者除了对病毒载体具有潜在的免疫反应外，对于基因治疗产品的产物蛋白（如有）也可能产生免疫反应，当受试者此前接受过相关蛋白的预治疗，特别是已使用过重组蛋白的替代产品。同样，在入组前和整个临床研究过程中应设计评估其免疫原性（如有产物蛋白），预存抗体高发生率的受试者可能需要检测治疗时出现的体液免疫反应，例如确定基因治疗产品给药后抗产物蛋白的ADA滴度倍数变化。

产物蛋白免疫原性的生物分析方法常用免疫分析法，在方法开发时应注意关键试剂的制备、标记试剂的获得、具有足够分析灵敏度和特异性的阳性对照抗体等。同时，内源蛋白干扰、结合配体的干扰在方法开发时也需要考虑在内，这可能会伴有非传统的解离、内源蛋白的消耗或外源产物蛋白富集方法的同步开发（如样品热处理或免疫沉淀），甚至需要在产物蛋白的免疫分析方法开发之前确定这些样品处理步骤。

细胞免疫原性

对于适应性细胞免疫应答，主要评估针对病毒载体和产物蛋白的T细胞免疫反应。酶联免疫斑点技术（Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISPOT）可检测T细胞免疫反应，通过将病毒载体与外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMCs）共同孵育，受到病毒载体刺激后的PBMC分泌IFN-γ或其它效应因子，对其进行检测和评估检测结果，如每百万细胞在病毒载体刺激下的斑点形成单位（Spot-forming units，SFU）数量和斑点形成单位数量相比单纯培养的增加量。通常，当病毒载体刺激免疫细胞时，样品SFU > 50且至少比对照高3倍时，判断为阳性（图5）。其高灵敏度的优势可涵盖特定细胞因子、抗原特异性抗体的检测、低水平分泌细胞的频率等相关试验的检测。相比ELISA检测方法或细胞内染色技术，ELISPOT能够在单细胞水平上检出细胞因子和效应分子的分泌。在检测前需要分离PBMC或者其它细胞亚群，通过自动化设备完成高通量的检测和筛选。

图5 细胞免疫原性检测结果

采用FluoroSpot Assay测定IFN-γ和TNF-α以评估AAV5衣壳蛋白和FVIII蛋白的细胞免疫反应。在基线和Roctavian®给药后的多个时间节点收集受试者的PBMC样品并冷冻保存。热图着色显示PBMC的响应强度（SFU/10^6 PBMCs），在测试样品中，结果< 50 SFU为阴性并表示为-，结果≥ 50 SFU为阳性并表示为检测数值，黄色单元5000表示PBMC响应强度> 5,000 SFU的阳性，空白单元表示因PBMCs过少无法测试。

生物标志物评估

生物标志物

基于生物标志物的生物分析方法对于诊断、预测、预后、安全性等的监控十分重要，推荐将生物标志物的生物分析研究纳入临床试验方案中，以形成完备的生物分析数据体系，这可能将更有利于基因治疗产品的上市申请。例如，在接受基因治疗的受试者可能引起血清中各类生物标志物变化，包括白介素家族（例如IL-2、IL-4、IL-8、IL-10）、促炎因子（例如IFN-γ、TNF-α）、生长因子（例如TGF-β）；免疫细胞数量、比例、表型的变化（如CD4+、CD8+ T细胞、NK细胞等）。生物标志物检测的难点在于合理地设计细胞因子检测panel、免疫细胞panel，以及选择适用的生物分析平台。预存抗体也可以视为一种预测性生物标志物用来筛排受试者，甚至，预存抗体有可能成为基因治疗产品的一种伴随诊断（Companion diagnostic，CDx）检测目标，医师可以根据受试者的预存抗体水平，判断其是否接受特定的基因治疗产品。