Introduction to Immunogenicity Assessment of Novartis Cell Therapy Kymariah®

CAR-T产品概况

Kymriah®是由诺华公司和宾夕法尼亚大学共同研发的全球首个上市的抗CD19嵌合抗原受体（CAR）T细胞免疫疗法，于2017年得到FDA批准，2018年得到EMA批准，由此开启了CAR-T这类突破性疗法的新纪元。到目前为止，FDA已经批准6款CAR-T免疫细胞疗法，其中4款以CD19为靶点，2款以BCMA为靶点。期间，我国药监局也于2021年6月和8月批准2款以CD19为靶点的CAR-T产品上市。已上市CAR-T产品信息见表1。

表1 全球已获批上市CAR-T药物信息

目前已上市的CAR-T疗法中，抗CD19靶点scFv序列（例如Kymriah®、Yescarta® / 奕凯达®和Tecartus®）均取自鼠FMC63母体抗体。在Yescarta® / 奕凯达®和Tecartus®的免疫原性检测中，阳性对照均由抗鼠FMC63抗体制备，筛选试验使用的是ELISA方法，而确证试验使用的是细胞分析方法。

Kymriah®的主要信息

自体T细胞免疫药物：Kymriah®与其它已批准上市的CAR-T治疗一样，都是一种自体T细胞免疫药物，因此T细胞排异/排斥作用的可能性非常低（该疗法流程见图1）。

图1. Kymriah®自体免疫细胞疗法流程示意图

注：1） 获取癌症患者T细胞；2）增强和激活患者T细胞；3）基因导入患者T细胞，使其成为能够特异性识别并消灭肿瘤的CAR-T细胞；4）CAR-T细胞扩增；5）制成符合质量要求的CAR-T细胞；6）将CAR-T细胞回输患者体内攻击肿瘤细胞并治愈癌症。

Kymriah®免疫原性的来源：Kymriah®的免疫原性主要来自于CAR-T细胞外表达的鼠源scFv，即CD19嵌合抗原受体部分（见图2，VL和VH部分）。由于其包含非人源序列区域，可导致患者体内产生人抗小鼠scFv抗体；有些患者经过其它疗法（类似此小鼠scFv片段）的治疗，在体内已经产生预存的抗小鼠scFv抗体。因此，评估CAR-T细胞产生的免疫原性是非常重要的。

图2. Kymriah® CAR-T结构示意图

Kymriah®免疫原性检测方法

检测方法的确定

1） 由于Kymriah®细胞疗法中患者来源的CAR-T细胞数量非常有限，无法建立患者特异性免疫原性测定方法。

2） Kymriah®经表达产生的蛋白称为CAR19（见图2，左侧蓝字标注），它包含鼠抗CD19的可溶性胞外域 scFv、CD8铰链区和跨膜区、CD137（4-1BB）共刺激结构域、以及CD3ζ活化结构域。如果仅使用CAR19的scFv（见图2，右侧蓝字标注）作为试剂，并基于ELISA的免疫原性测定方法进行检测，就可能因为不具有CD8铰链区和跨膜结构域，在一级结构和构象上与膜结合CAR19不同，会造成漏检一些抗CAR19抗体。

3） 用CAR19慢病毒载体转导的Jurkat细胞系（下面简称CAR19细胞）作为替代Kymriah®的阳性对照，用荧光素酶转导的野生型Jurkat细胞（WT细胞）作为阴性对照，建立基于流式细胞术的测定方法，见图3。

A. CAR特异性信号（CAR specific signal）：见图3中A，此试验用CAR表达细胞（CAR19-expressing cells）进行，血清样品与细胞孵育后，通过抗药抗体（ADA）与CAR19结合、检测试剂（抗IgG/M）与ADA结合产生的特异性信号。

B. WT细胞非特异性信号（WT cell unspecific signal）：图3中B，此试验用野生型Jurkat细胞进行，抗IgG/M与非特异性抗体结合产生的信号，即Jurkat细胞的背景信号。

C. CAR表达细胞产生的特异性和非特异性信号：图3中C，此试验用表达CAR的Jurkat细胞进行，血清样品与细胞孵育后，同时产生特异性和非特异性信号。推测，该方法是基于在血清样品中加入等量的CAR表达细胞和野生型Jurkat细胞所产生的非特异性信号（背景信号）值相等的假设，CAR特异性ADA信号等于CAR表达细胞总信号值与野生型Jurkat细胞的非特异性信号值之间的差值。

图3. CAR特异性ADA信号等于CAR19细胞检出的信号与WT细胞的非特异性信号之间的差值

免疫原性方法开发和验证

1） 健康人血清中部分样品有预存抗CAR19抗体：在用20个健康人血清分别加入WT细胞和CAR19细胞后，检测到的中位荧光强度（Median fluorescence intensity，MFI）均在相当大的区间变化，证明样品中不仅有预存抗Jurkat细胞的抗体存在，也有预存抗CAR19的抗体存在。

2） 健康人血清与WT细胞（蓝色）和CAR19细胞（红色）结合所产生信号值，见图4，为3次独立试验的总结果。

图4. 评估20份血清对WT细胞（蓝色）和表达CAR19细胞（红色）的IgG/M的结合

3） 灵敏度的确定：由于健康人血清有不同程度的预存抗体存在，影响到对免疫原性方法灵敏度的确定，因此，选择去除Ig的血清来确定免疫原性试验的灵敏度。图5为3次试验的总结果，证明免疫原性试验的灵敏度满足100 ng/mL的要求。

图5. 用去除Ig血清确定灵敏度

注：1）去除Ig混合血清+/-100 ng/mL抗CAR19阳性对照抗体与WT细胞（蓝色）和CAR19细胞（红色）孵育，两细胞的MFI差异显著。2）20个去除Ig血清+100 ng/mL抗CAR19阳性对照与两种细胞孵育的MFI。

4） 确定筛选临界值因子（Screening assay，Cut point factor，CPF）：由于健康人血清有不同程度的预存抗CAR19抗体，无法建立CPF，因此，选择62份去除Ig血清进行重复分析并确定CPF值，结果为：CAR19细胞的CPF为2.16，WT细胞的CPF为1.45。在使用来自患者人群的血清时，确定的CPF值要达到ADA筛选试验的假阳性率约为5%，确证试验的假阳性率约为1%。

5） 精密度/再现性：

A. 阴性对照（Negative control，NC）：去除Ig的混合血清用作阴性对照

B. 阳性对照（Positive control，PC）：在阴性对照中加入阳性对照抗体配制高浓度阳性对照HPC（80 μg/mL of high positive control）和低浓度阳性对照LPC（0.3 μg/mL of low positive control）。

C. 为确保测定一致性，由两名分析人员使用三次独立配制的NC、两次独立配制的高浓度阳性对照HPC（80 μg/mL）和低浓度阳性对照LPC（0.3 μg/mL）在数天进行了17个批次的试验，使用MFI值计算CV，批内和批间精密度均在30%以内，符合验证接受标准。

6） 药物干扰：因血清样本中不存在自体CAR19 T细胞。因此，在抗CAR19抗体测定中未评估药物干扰。

7） 滴度评估：针对两个细胞系121个血清样品测量的筛选MFI与相应观察到的滴度进行对比，无论是WT细胞（蓝色）还是CAR19细胞（红色），MFI与滴度均呈正相关线性（图6）。按照指南的建议，将滴定临界值（Titration cut point，TCP）设置在筛查临界值（1.45）之上，对于临床研究的研究样本，选择TCP为1.50。

图6. 滴度评估

8） 确证试验：使用WT细胞和CAR19细胞，对6份血清（IS 1 ~ IS 6）加入可溶性CAR19蛋白（无CD8铰链和跨膜蛋白）进行确证试验评估（见表2）。其中IS 1 ~ IS 5的信号抑制率在23% ~ 73%之间，确证为阳性样品，IS 6的信号抑制率为11% ，为阴性样品。

表2 可溶性CAR19蛋白对CAR19-特异性信号的抑制作用

样品分析和数据评估依据

见图7，共分三个层次，归纳如下几点：

1） 性能测试：决定数据是否需要重新分析。

以CAR19细胞为阳性对照，检测其CP（Cut point），即CP CAR19 = NC信号ⅹCPF CAR19；

以WT细胞为阴性对照，检测其CP，即CP WT = NC信号ⅹCPF WT。

如果满足接受标准，进入对照样品分析；如果失败，重复试验。

图7. 样品分析和数据评估依据

2） 对照样品分析：决定对照样品是否达到可接受标准，达到要求，可进一步分析患者样品。

对照样品信号CAR19 = 信号CAR19 – 信号WT；

当信号CAR19 ≥ CP CAR19时，对照样品免疫原性为阳性；当信号CAR19 < CP CAR19时，对照样品免疫原性为阴性。

3） 患者样品分析：

A. 患者特异性CP = 患者给药前信号ⅹCPF CAR19。

B. 给药前和给药后的患者样品免疫原性均为阴性，则该患者Kymriah®治疗的免疫原性为阴性。

C. 给药前患者样品免疫原性为阴性，给药后的免疫原性为阳性，则该患者经Kymriah®治疗诱导产生了免疫原性。

D. 给药前和给药后的患者样品免疫原性均为阳性，且阳性程度相当，则该患者有预存抗体存在。

E. 给药前和给药后的患者样品免疫原性均为阳性，且给药后阳性程度增加，则该患者有预存抗体存在，且经Kymriah®治疗增强了免疫原性。

总结

从Kymriah®用于评估免疫原性的检测方法来看，因其考虑给药类似的接近理想体系的目的，建立了一个颇为复杂、也是第一种基于细胞的体液免疫原性试验方法。该方法成功地用于临床试验，数据有力地支持了Kymriah®的批准和上市。作者在其文章的最后也提到，应该考虑使用比较简单的方法来检测CAR-T疗法的免疫原性。后面几款抗CD19 CAR-T产品的上市，也证明了无论是采取基于细胞的方法，还是采取配体结合试验（如使用ELISA平台），只要能够说明患者体内的免疫原性对CAR-T细胞的初始扩增和持续存在的动力学、药物的安全性和有效性、和重复给药等治疗过程未造成影响，这样的免疫原性的分析方法和分析结果也是可以得到审核机构认可和接受的。